Dokumentumok
Molekuláris Patológiai Laboratórium
KPS Molekuláris Diagnosztikai Központ
Molekuláris Diagnosztikai központunk világszínvonalú technológiai felszereltséggel rendelkezik. Molekuláris patológiai laborunkban Zeiss lézermikrodisszekciós mikroszkóp, AIB3130 szekvenátor, Lightcycler 480II segítségével az összes modern molekuláris diagnosztikai vizsgálat elvégzésére mód van. Ezt egészíti ki 2009 Januárjától egy genomszekvenátor laboratórium, amelynek segítségével 1 millió génszekvencia analízise lehetséges párhuzamosan és ezáltal új korszak nyílik a molekuláris patológiai és genetikai kutatások és a személyre szabott orvoslás számára. A KPS rutin molekuláris diagnosztikai algoritmusa három egymást kiegészítő korszerű, részben saját, hazai innovációt tartalmazó technológiai elemből áll össze, oly módon, hogy az alkalmas legyen, archivált patológiai minták, formalin fixált biopsziás minták, citológiai kenetekben gén mutációk kimutatására - mint például a KRAS és az EGFR mutációi - még abban az esetben is, ha a mintában csak kevés daganat sejt található vagy a DNS erősen töredezett. Az egymást kiegészítő, egy laboratóriumban elhelyezkedő technológiákat együttesen KPS Domino Gene Scanning technológiai platformnak neveztük el, amely érzékeny, gyors és költséghatékony. Ez a technológia minden tekintetben felveszi a versenyt, vagy felülmúlja a jelenleg alkalmazott és nemzetközi ajánlásokban szereplő módszereket. A technológiai platform előnye, hogy nem „hot spot” függő, azaz bármilyen génszakasz vizsgálatára gyorsan adaptálható függetlenül attól, hogy a lehetséges mutációk egy bizonyos kodonban fordulnak elő vagy változatosan szóródnak el az adott génszakaszon. A rendkívül érzékeny technológiák infrastrukturális hátterét egy vadonatúj, a molekuláris diagnosztikai igényeire tervezett laboratórium biztosítja ahol a munkafázisok térben elkülöníthetők és a helységek teljes UV dekontaminációja megoldott.
Szekvenálási Technológia
A mutációk kimutatásának „gold standard”, egyetlen 100%-ban specifikus módja a szekvenálás. Munkacsoportunk szekvenálással megállapított EGFR mutációk esetében gyakorlatilag 100% biztonsággal azonosítani tudta az erlotinib és gefitinib kezelésre objektív klinikai válasszal reagáló tüdő adenokarcinómás betegeket . A szekvenálás azonban csak 30% tumor arány felett elég szenzitív ezért szükség lehet makrodisszekcióval vagy LCM-el történő dúsításra, azonban ezek is megoldottak laboratóriumunkban A szekvenálás másik technológiai problémája, hogy a DNS gyakran rendkívül fragmentált, ezért a PCR termék méretének növelése drámai módon csökkenti a PCR hatékonyságát és gyakran a szekvenálás sikertelenségét okozza. A KPS kutatói olyan technológiát dolgoztak ki, amelynek segítségével ezt a technológiai problémát sikerült megoldani és még a költséghatékonyságot is növelni lehetett. Ezért amennyiben mutációk jelenlétének 100% megerősítése a cél akkor a KPS szekvenálási technológiája lehet az egyetlen megoldás. A szekvenálást ABI 3130-as 16 csatornás automata szekvenátorral végezzük. A kiadvány elkészültéig a labor 3000 szekvenálási reakciót végzett el archivált szövetmintákból izolált DNS mintákból.
Zeiss/PALM Laser Capture Microscopy (LCM)
Amennyiben a szövettani metszettben vagy a kenetben a daganatos sejtmagok aránya kevesebb, mint 30%, például nagy mennyiségű kötőszövet vagy fehérvérsejt (lobsejt) beszűrődés miatt, akkor biztonságosan csak akkor végezhető szekvenáláson alapuló molekuláris diagnosztikai vizsgálat, amennyiben a daganatsejteket a patológus szakorvos lézernyalábbal „kivágja” a mintából. A kompetitor LCM technológiák közül csak a Zeiss birtokában lévő PALM technológia képes arra, hogy a kivágott sejteket egy elektromágneses lökéshullámmal egyenesen a PCR csőbe „lője”. Ezért nem kell külön speciális fóliára készíteni metszetet és így archivált citológiai kenetekről a daganatos sejtmagok egyesével is kiválaszthatók a vizsgálatra. A szekvenálás és az LCM kombinációja gyakorlatilag 100% specificitást és szenzitivitást biztosít és ezáltal ez a módszer tekinthető a gold standardnak, amihez a nemzetközi ajánlások szerint a többi módszert validálni kell.
Real-time PCR alapú vizsgálatok
A KPS laboratóriumában a világpiacon található legnagyobb teljesítményű HRM qPCR, az LC480 II áll rendelkezésre, amely az egyetlen olyan HRM funkcióval rendelkező készülék, amelyben párhuzamosan 96 vagy akár 384 minta vizsgálható. Amennyiben a vizsgálandó mintában a daganatsejtek aránya kicsi akkor vizsgálat előtt lézer mikrodisszekcióra van szükség. Amennyiben az olvadási görbe alakja nem azonosítja egyértelműen a mutáció fajtáját akkor szekvenálásra lehet szükség. Mindkét, („domino” szerűen) komplementer technológia rendelkezésre áll a KPS laboratóriumában. A LC480-as készülék, qPCR vizsgálatokra, end-point genotyping-ra, melting curve analízisre és allél specifikus qPCR vizsgálatokra (ARMS) is alkalmas. A mutációk kimutatásának jelenleg elérhető leggyorsabb és legköltséghatékonyabb módszere „Gene Scanning”. Lényege, hogy a PCR amplifikáció során felsokszorozott mutációt tartalmazó és a vadtípusú DNS szálak, illetve az ezekből létrejövő „heteroduplex”-ek olvadáspontja egymástól eltérő, és ezt erre speciálisan kifejlesztett, (HRM funkcióval rendelkező) valósidejű PCR készülékkel detektálni lehet. A hasonló elven működő „melting curve” esszével szemben nincs szükség külön jelzett próbára és nem csak a „hot spot” helyen lévő mutációk kimutatására alkalmas, hanem a célszekvenciában azok bárhol elhelyezkedhetnek. A módszer előnye, hogy a PCR amplifikáció után a teszt cső kinyitása nélkül, egy lépésben azonnal megtörténik a vizsgálat, ami kizárja a keresztkontamináció lehetőségét, és rendkívüli vizsgálati sebességet tesz lehetővé (<2 óra).
Genomszekvenátor laboratórium
A KPS nagy valószínűséggel elsőként fog hazánkban, illetve kelet-Európában üzembe helyezni 2009. január 1-ig egy második generációs, úgynevezett Genomszekvenátort 150 millió Forint beruházással. A genomszekvenátorok forradalmasítani fogják a személyre szabott molekuláris medicinát. A készülék egyetlen vizsgálat alatt 1 millió (!) szekvencia párhuzamos analízisére lesz képes. Az egy mintára jutó költség a mostaninak a töredéke lesz. Ez azt jelenti, hogy több száz beteg, több tucat génszekvenciájának 1000-szeres párhuzamos vizsgálatát fogjuk elvégezni, ami a daganatok genetikai heterogenitásáról is „ultra deep” képet fog nyújtani, ami a recidívák molekuláris mechanizmusáról is prediktív információt nyújthat.
Fórum
Gyulladásos bélbetegségek Sziasztok,Ja igen, Tihany!Majdnem
2010, Június 24. 16:28 Csizkat
Gyulladásos bélbetegségek hmm, azert az rendjen van,
2010, Június 20. 21:39 Richard
Gyulladásos bélbetegségek Ezek olyan dolgok, hogy
2010, Június 14. 09:55 chysh
